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【LNP/AAV】藥物載體的生物物理表征方法

更新時(shí)間：2022-09-14       點(diǎn)擊次數(shù)：1421


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【LNP/AAV】脂質(zhì)載體的生物物理表征方法




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利用光散射和量熱技術(shù)對(duì)用于疫苗和治療的病毒和脂質(zhì)載體進(jìn)行生物物理表征


作者：Natalia Markova, Stefan Cairns, Hanna Jankevics-Jones, Michael Kaszuba, Fanny Caputo and Jérémie Parot


近期，馬爾文帕納科應(yīng)用科學(xué)家和挪威SINTEF工業(yè)生物技術(shù)和納米醫(yī)學(xué)部的科學(xué)家們?cè)赩accines雜志上發(fā)表一篇名為《利用光散射和量熱技術(shù)對(duì)用于疫苗和治療的病毒和脂質(zhì)體進(jìn)行生物物理表征》的文章。


文章對(duì)多種用于新型疫苗研發(fā)制造的病毒或非病毒載體的表征方法做了專業(yè)的介紹。文中所述多種無(wú)標(biāo)記生物物理技術(shù)作為互補(bǔ)的分析工具可廣泛用于AAV 和LNP的設(shè)計(jì)、表征和質(zhì)量控制。且已經(jīng)成功的用于表征AAV和LNP等藥物載體的物理、化學(xué)屬性，本文將對(duì)該項(xiàng)研究做簡(jiǎn)要介紹。


原文：Vaccines 2022, 10, 49


1

引言


病毒載體和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性影響其功能和藥物配方的成功性。這類分子被用作核酸（mRNA，DNA）的遞送平臺(tái)后，如何準(zhǔn)確表征這些顆粒變得越來(lái)越重要。


在設(shè)計(jì)、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制中，理化屬性的表征和質(zhì)量控制需要選擇合適、互相補(bǔ)充的分析工具。選擇合適的技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)樣品需要考慮載體的性質(zhì)、測(cè)量處于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的哪個(gè)階段、以及測(cè)量的目的?？煽康臏y(cè)量結(jié)果和對(duì)數(shù)據(jù)的充分解析依賴深厚的方法學(xué)專業(yè)知識(shí)和全面的數(shù)據(jù)分析方法。


這里，我們將介紹如何通過(guò)綜合使用互相補(bǔ)充的、非標(biāo)記生物物理技術(shù)，包括動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、多角度光散射（MADLS）、電泳光散射（ELS）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）、多檢測(cè)器SEC和差示掃描量熱法（DSC），表征包裹mRNA的病毒載體和LNPs的理化屬性。



2

樣品


使用病毒和非病毒載體樣品，包括包裹mRNA的脂質(zhì)納米顆粒（mRNA-LNPs），脂質(zhì)體和腺相關(guān)病毒（AAV）。


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測(cè)量?jī)?nèi)容與檢測(cè)技術(shù)


Zetasizer Ultra


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Zetasizer Ultra 納米粒度及電位分析儀

Zetasizer Ultra 是快速而準(zhǔn)確地測(cè)量顆粒和分子大小、顆粒電荷以及顆粒濃度的伴侶，其擁有用于高分辨率粒度測(cè)量切角度無(wú)關(guān)的多角度動(dòng)態(tài)光散射（MADLS）技術(shù)可以更深入地展現(xiàn)樣品的顆粒分布，電泳光散射（ELS）技術(shù)可用于測(cè)量顆粒和分子的Zeta電位，以顯示樣品的穩(wěn)定性和/或團(tuán)聚傾向性。可以用于rAAV 顆粒的粒徑及衣殼滴度的表征。


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NanoSight NS300

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Nanosight NS300 納米顆粒跟蹤分析儀

采用納米粒子跟蹤分析 (NTA) 技術(shù)，馬爾文帕納科NanoSight 這種技術(shù)利用光散射和布朗運(yùn)動(dòng)的特性，獲得納米顆粒大小 0.01 - 1µm及顆粒濃度，以及實(shí)時(shí)表征蛋白質(zhì)聚合(聚集)的解決方案。這使得 NTA成為病毒疫苗研究、納米毒物學(xué)和生物標(biāo)志物檢測(cè)以及疾病狀態(tài)研究的細(xì)胞外囊泡、外泌體表征的重要技術(shù)。


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MicroCal PEAQ DSC

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MicroCal PEAQ DSC差示掃描量熱儀

差示掃描量熱法（DSC）是一種功能強(qiáng)大的分析技術(shù)，用于表征和分析蛋白質(zhì)和其他生物分子的熱穩(wěn)定性。

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OMNISEC

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OMNISEC 尺寸排阻色譜儀

OMNISEC是個(gè)多檢測(cè)器SEC系統(tǒng)，包括示差檢測(cè)器（RI）、紫外檢測(cè)器（UV）、光散射檢測(cè)器（LS）和粘度檢測(cè)器（IV）?？梢杂糜诒碚骱脱芯扛街谥|(zhì)納米顆粒顆粒遞送載體上的藥物量以及產(chǎn)品的分子量和結(jié)構(gòu)。


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測(cè)量案例展示


粒徑分布測(cè)量


使用DLS、MADLS、NTA和SEC-SLS/UV/RI測(cè)量不同大小、不同粒徑分布的樣品。

樣品：圖A/B LNP1，C/D LNP2，E/F 脂質(zhì)體，G/H AAV


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顆粒濃度測(cè)量


使用MADLS、NTA和SEC-SLS/UV/RI。需要根據(jù)載體大小選擇合適的技術(shù)，這也決定了可測(cè)量的濃度范圍。


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Zeta電位測(cè)量


Zeta電位可用于測(cè)量粒子在緩沖液/培養(yǎng)液中的電荷。下例是使用Zetasizer選配的MPT3滴定儀評(píng)估樣品在pH 2.5-9.5范圍內(nèi)的行為。樣品LNP1和LNP2的區(qū)別僅在于使用的可電離脂質(zhì)不同，在pH 4.5-7區(qū)間可見(jiàn)二者的差異。


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有效載荷比測(cè)量


使用SEC-SLS/UV/RI測(cè)量LNPs內(nèi)mRNA的比率。

樣品：a) LNP1；b) LNP2

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熱穩(wěn)定性


下述DSC熱譜圖分別是（A）同一個(gè)LNP2樣品取2份進(jìn)行測(cè)量，展示了測(cè)量良好的可重復(fù)性（B）對(duì)比不同批次LNP2，結(jié)果差異較大（C）溶液中游離mRNA的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和部分可逆性。

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主要結(jié)論

1

互補(bǔ)和正交的分析技術(shù)是驗(yàn)證和/或洞察樣品行為的重要工具。      

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測(cè)量顆粒大小和濃度時(shí)，選擇何種分析方法主要取決于載體的大小和粒度分布。同時(shí)，分析的目的也會(huì)影響分析方法的選擇，比如是想了解樣品自上一步驟以來(lái)是否發(fā)生了變化，還是樣品中存在哪些低聚形態(tài)，每種形態(tài)占比多少？

3

Zeta電位可提供樣品在緩沖液中的電荷信息，或是如本文案例中，用于了解使用不同脂質(zhì)體的樣品在一定pH范圍內(nèi)的差異。

4

 使用SEC-SLS/UV/RI系統(tǒng)的光散射和雙濃度檢測(cè)器進(jìn)行樣品的分離和分析，可分別量化脂質(zhì)體和mRNA，如本文中測(cè)量的LNP中的mRNA質(zhì)量百分比。

5

DSC可用于研究復(fù)雜LNP體系及其中組分如mRNA的熱誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。DSC熱譜圖可用作定性和定量的指紋圖譜，用于樣品批次一致性的分析。